一，試劑盒組份

組份 (50T) (100T) 保存溫度
DNase I 12mg 12mg*2 -20℃溶解后分裝
RNase A 0.5ml 0.5ml*2 -20℃保存 經常使用可2-8℃放置
紅細胞裂解液（10X） 100ml 100ml*2 2-8℃
細胞裂解液 50 mL 100 mL 2-8℃
線粒體清洗液 25 mL 50 mL 2-8℃
DNA酶反應液 6ml 12ml 2-8℃
線粒體裂解液 10ml 20ml 常溫放置，如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液 7.5ml 15ml 2-8℃
核酸助沉劑 0.5ml 1ml 2-8℃
TE緩沖液 25ml 50ml 2-8℃

二，保存條件

本試劑盒整體保存于2-8℃一年，DNASE I和RNase A  -20℃保存。使用前，在DNASE I中加入600ul的DNA酶反應液，溶解分裝后-20℃保存三個月，溶解后的DNASE I如果超過三個月，活性可能會降低，請自行訂購DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影響使用。

三，說明

本試劑盒可用于從血液中分離完整而純化的線粒體DNA。

線粒體DNA提取的關鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體，再利用DNA酶消化和裂解緩沖系統等多步驟去掉核DNA，最后得到純凈的線粒體DNA。可用于PCR等對純度要求較高的實驗。

四，操作步驟

準備工作：在12mg DNASE I中加入600ul的DNA酶反應液，適當分裝后-20℃保存。紅細胞裂解液（10X）用雙蒸水稀釋10倍成工作液（如標本為有核紅細胞血液，此試劑用不上，需自備生理鹽水或者PBS）。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解。離心機溫度下降到4℃（2-8℃），如無低溫離心機，也可以常溫離心，并將所有離心時間為10min的改為5min，但最后所得DNA品質及產量會有一定影響。

1. 血液處理：

血液要求：非肝素鈉抗凝血，最好使用新鮮血液。對于陳舊血液，由于凍凝過程中冰晶已經對細胞核膜和線粒體膜產生損傷，所以線粒體DNA得率會大大減少。

a. 對于無核紅細胞全血（如哺乳動物處周血），取血約3-5ml（適當分成幾管），加入3倍體積的紅細胞裂解液（稀釋后的工作液,下同），混勻，800 × g  5 min離心收集白細胞。加入1-2ml紅細胞裂解液（稀釋后的工作液），吹打重懸白細胞，合并于一管中，800 × g 5~10 min離心收集白細胞。此時如果白細胞有可見紅色，可再次用少量(0.5ml)紅細胞裂解液洗細一次。

b. 對于有核紅細胞全血（如禽類全血），取約300-500ul全血，800 × g 5~10 min離心收集全細胞，用生理鹽水或者PBS清洗兩次，留沉淀去上清。清洗時請用去尖吸頭吹打。

2. 在收集到的細胞中，加入1.0 mL冰預冷的細胞裂解液重懸細胞，將細胞懸液轉移到小容量玻璃勻漿器內，0℃冰浴研磨20~40次；

3. 勻漿物轉移到離心管，4℃，1000× g 離心5 min；

4. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000× g 再次離心5 min（一共兩次離心，完整去核）。

5．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉移到新離心管，線粒體沉淀在管底；

6. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL 線粒體清洗液重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；

7．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

8. 加入100ul DNA酶反應液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10ul DNASE I溶液（見準備工作），混勻，37℃水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃， 12,000 × g 離心5 min。盡可能的棄上清，再加入200ul TE 重懸線粒體沉淀，4℃， 12,000 × g 離心5 min，洗去殘留的DNA酶。

9.得到的沉淀，用200ul TE緩沖液重懸線粒體沉淀，加入10ul  RNase A。加入200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃， 12,000 × g 離心5 min。此步驟可進一步去除核DNA。

10．取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚氯仿異戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體DNA的損失，因而用于PCR時可省，并不影響后續實驗），加入0.6倍體積的異丙醇（如無異丙醇，可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA，如離心管太滿可分兩管）及5-10ul 核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時左右（此步可省），4℃， 12,000 × g 離心10 min。

11. 棄上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 12,000 × g 離心5min。重復用70%乙醇洗一次。

12. 棄上清，再次離心1min 吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼干約5-10min。

13．加入10-20ul TE緩沖液,輕彈管底，37℃水浴5分鐘，線粒體DNA溶解。

14. 進行DNA檢測及-20℃保存，進行下步的實驗。

以上方法可以比較完整的去掉核DNA（達到PCR無法檢測的級別）但過程復雜，線粒體DNA丟失較多，以下為簡單方法，也可以比較好的提到線粒體DNA，在裂解時間合適的情況下，也能去核DNA（達到電泳檢測不到的級別）。

1．血液常規處理（紅細胞裂解或者全血清洗）

2．200ul TE緩沖液重懸全細胞，加入10ul  RNase A，加入200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置2-3min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃， 12,000 × g 離心5 min。

3．取上清，接上面第10步，氯仿抽提，乙醇沉淀。

四 注意事項：

1. 為保證獲得完整及盡可能多的線粒體，勻漿條件要示：第一是全程低溫操作。第二是快速。第三，如有條件可將勻漿后的碎片在顯微鏡下觀察。

2．線粒體DNA本身含量很低，如果電泳檢測不到，可加大上樣量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接進入PCR檢測。

2. 以離心力g計算正確的離心速度，不同的離心機可據此精確計算離心速度。

一般低溫離心機都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算。

轉速與離心力換算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２

G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數來表示；

 [rpm] ^２即：轉速的平方； R為半徑，單位為厘米。